PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI, PEWARNAAN TUNGGAL DAN PEWARNAAN MAJEMUK

PEMBUATAN PREPARAT BAKTERI, PEWARNAAN TUNGGAL
DAN
PEWARNAAN MAJEMUK

Tujuan : Mampu mempersiapkan sediaan/film bakteri secara benar.
: Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan zat satu macam warna.
: Mampu melakukan pewarnaan bakteri dengan zat banyak macam warna.
: Mengamati dan menggambar bakteri yang telah diwarnai


A. PENDAHULUAN
Ilmu yang mempelajari bentuk, sifat, kehidupan, penyebaran dan manfaat jasad hidup termasuk mikroba yang lebih lazim disebut dengan mikrobiologi yang di dalamnya mencakup satu kelompok besar jasad hidup yang mempunyai bentuk dan ukuran sangat kecil, serta sifat hidup yang berbeda dengan jasad lain umumnya. Seperti bakteri yang memiliki salah satu sifat penting adalah kemampuan beberapa jenis bakteri untuk memproduksi struktur internal yaitu endospora. Endospora ini umumnya terbentuk secara tunggal dalam sel guna menanggulangi keadaan lingkungan yang kurang baik. Spora yang sudah masak dilepas oleh sel ke alam sekitarnya. Spora-spora ini dapat dilihat di bawah mikroskop fase kontras dan tampak sebagai bagian yang bercahaya terang baik di dalam atau di luar sel. Spora-spora ini tahan terhadap keadaan fisik atau kimia yang ekstrim seperti suhu, kekeringan, dan bahan-bahan kimia pembasmi kuman dan dapat bertahan dalam keadaan tidur untuk beberapa tahun. Pada saat kondisi memungkinkan, spora-spora tersebut tumbuh menjadi sel-sel vegetatif yang normal.
Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi bakteri, fungi, dan khamir dengan menggunakan metode gores, metode tuang, metode sebar, metode pengenceran serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah tekhnik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies individu spesies dapat dipisahkan dari lainnya.
Pemahaman mengenai teknik dasar dalam praktikum mikrobiologi, seperti pengenalan ose serta cara menggunakannya, dan teknik plating sehingga seorang praktikan dapat melakukan praktikum mikrobiologi yang sesuai dengan kaidah serta ketentuan yang berlaku merupakan hal yang terpenting. Berbagai jenis ose yang dikenal serta penggunaannya disesuaikan dengan mikroorganisme yang akan diteliti, baik dalam hal pemindahan maupun pemilihan dari suatu koloni. Teknik plating dan ose merupakan satu kesatuan sehingga keduanya memiliki keterkaitan satu sama lainnya (karena teknik plating dilakukan dengan menggunakan ose). (Hadioetomo, 1993).
Dalam pembuatan preparat native alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, cover glas, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ), alkohol 95% dan aquades. Proses pembuatan preparat native bakteri yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. proses pembuatan preparat native kapang sistemnya sama yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni kapang pada agar miring PDA ( Potatoes Dextrose Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan aquades 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut lalu ditutup dengan cover glass, lalu diamati di bawah mikroskop dan digambar. (http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html)(23/10/2009).
Dalam pembuatan preparat ulas alat dan bahan yang digunakan yaitu mikroskop, objek glass, kawat ose, bunsen, pipet tetes, koloni mikroba agar miring ( bakteri, kapang, dan khamir ), alkohol 95% dan metilen biru. Proses pembuatan preparat ulas bakteri yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni bakteri pada agar miring PCA ( Plate Count Agar ) secara hati – hati, lalu taruh koloni bakteri tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni bakteri tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni bakteri tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan preparat ulas kapang yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA (Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni kapang tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni kapang tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni kapang tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi dimana fungsi fiksasi yaitu melekatkan mikroba pada obyek glass, memperjelas pengamatan dibawah mikroskop, dan membunuh mikroba. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar. Proses pembuatan preparat ulas khamir yaitu kawat ose dipijarkan di atas api bunsen, setelah itu ambil koloni khamir pada agar miring PDA (Potatoes Dextrose Agar) secara hati – hati, lalu taruh koloni khamir tersebut di atas objek glass. Penempatan koloni khamir tersebut tidak boleh terlalu tebal karena untuk memudahkan pengamatan. Setelah itu tambahkan metilen biru 1 tetes dengan pipet tetes pada koloni khamir tersebut dan didimakan selama 1 menit, lalu difiksasi. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dan digambar.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html)(23/10/2009).
Mikroorganisme yang ada dialam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan. Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan (Dwidjoseputro, 1989)
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya (Volk & Wheeler, 1993).
Zat warna adalah senyawa kimia berupa garam-garam yang salah satu ionnya berwarna. Garam terdiri dari ion bermuatan positif dan ion bermuatan negatif. Senyawa-senyawa kimia ini berguna untuk membedakan bakteri-bakteri karena reaksinya dengan sel bakeri akan memberikan warna berbeda. Perbedaan inilah yang digunakan sebagai dasar pewarnaan bakteri. Sel-sel warna dapat dibagi menjadi dua golongan yaitu asam dan basa. Jika warna terletak pada muatan positif dari zat warna, maka disebut zat warna basa. Jika warna terdapat pada ion negatif, maka disebut zat warna asam. Contoh zat warna basa adalah methylen blue, safranin, netral red, dan lain-lain. Zat warna asam umumnya mempunyai sifat dapat bersenyawa lebih cepat dengan bagian sitoplasma sel sedangkan zat warna basa mudah bereaksi dengan bagian-bagian inti sel. Pewarnaan bakteri dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup (http://blogkita.info/my-kampuz/my-kuliah/mikrobiologi/pembuatan-preparat-pengecatannya/) (23/10/2009)
Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah ”pewarna sederhana” dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu preparat yang sudah meresap suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka semua zat warna terhapus. sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang khas bagi suatu spesies (Dwidjoseputro, 1989).
Kebanyakan bakteri dapat diwarnai dengan pengecatan sederhana atau pengecatan gram, tetapi beberapa genus anggota dari genus Mycobakterium, bersifat resisten dan hanya dapat dilihat dengan metode tahan asam. Karena M. taberculosis dan M. leprae bakteri yang patogenik bagi manusia, maka pengecatan itu bernilai diagnosa dalam mengidentifikasi mikroorganisme tersebut. Perbedaan sifat antara mycobacterium dengan mikroorganisme lainnya adalah dengan adanya suatu dinding tebal yang berlilin (lipoidal) yang menyebabkan penetrasi oleh zat warna menjadi sulit. Akan tetapi, apabila zat warna sudah dapat masuk, zat warna terssebut jadi tidak mudah dibuang meskipun dengan penggunaan asam alcohol yang kuat sebagai zat pelarutnya. Dengan sifat yang demikian, mikroorganisme yang demikian disebut mikroorganisme tahan-asam dan mokroorganisme lainnya yaitu yang mudah dilarutkan dengan asam alcohol disebut mikroorganisme tidak tahan asam. Metode ini mengunakan tiga macam zat kimia yang berbeda. 1) zat warna primer, yaitu karbon Fuchin, 2) zat peluntur warna, 3) counterstain, yaitu metilen biru (Subandi, 2009).
Teknik pewarnaan Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis cat pewarna untuk mewarnai organisme. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam-macam tipe morfologi (coccus, vibrio, basillus, dsb) dari bahan-bahan lainnya yang ada pasa olesan yang diwarnai (Hadiotomo, 1990).
Pewarnaan negatif, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina (http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/)(23/10/2009)



B. ALAT DAN BAHAN

1. Pembuatan Preparat Bakteri
No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Fuchsin
2 Kaca objek 2 Metylen blue
3 Jarum ose 3 Alkohol 75%
4 Bunsen
5 Baki
6 Tisu
2. Pewarnaan Tungga
No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Preparat bakteri Bacillus dan Sarcina
2 Kaca objek 2 Fuchsin
3 Jarum ose 3 Gentian violet
4 Pipet tetes 4 Methylene blue
5 Aquades
6 Alcohol
7 Kertas hisap

3. Pewarnaan Majemuk
No Alat No Bahan
1 Mikroskop 1 Preparat bakteri Bacillus dan Sarcina
2 Kaca objek 2 Fuchsin / safranin
3 Jarum ose 3 Gentian violet
4 Pipet tetes 4 Methylene blue
5 Aquades
6 Alkohol
7 Kertas hisap
8 Larutan lugol
9 Minyak imersi
C. CARA KERJA
1. Pembuatan Preparat Bakteri Dan Pewarnaan Tunggal
Bersihka atau sterilkan objek glas pakai alkohol

Nyalakan Bunsen dan pijarkan jarum ose

Ambil kultur bakteri sedikit saja

Gesekan pada objek glas

Kalau menggumpal tetesi dengan air dan hisap pake kertas hisap

Fiksasi (dibilas dengan api 3x)

Diamkan sampai kering

Beri pewarnaan (fuchsin atau metylene blue) 20 detik

Bilas dengan air untuk menghilangkan zat warna yang lebih

Amati di mikroskop

2. Pembuatan Pewarnaan Majemuk
1. Preparat bakteri tetesi dengan Gentian violet (30 detik)

Bilas aquades

2. Larutan lugol (30 detik)



Bilas aquades
Alkohol 95 % (15 detik)
3. Safranin / Fuchsin (30 detik)

Bilas aquades
Keterangan : Gram (+) Ungu, Gram (-) Merah

D. HASIL PENGAMATAN
a. Pembuatan Preparat Bakteri


Objek Gelas Bacillus Subtillis

Methylene blue


b. Pewarnaan Tunggal
Bakteri Basilus Subtilis
Gambar Pengamata di bawah Mikroskop Gambar Sumber Literatur









(http://www.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccImages/Articleimages/Chamberlain/Bacillus%20subtilis%20spores%20fig1.jpg) (26/11/2009)





c. Pewarnaan Majemuk
Bakteri Basilus Subtilis
Gambar Pengamata di bawah Mikroskop Gambar Sumber Literatur










(http://www.surrey.ac.uk/SBMS/ACADEMICS_homepage/mcfadden_johnjoe/img/bacillus_anthracis_spore_forming.jpg) (26/11/2009)


E. PEMBAHASAN
Membuat preparat bakteri
Pada praktikum ini kita membuat preparat bakteri, sebelum membuat preparat bakteri usahakan semua alat dan media yang digunakan tersebut harus steril. Sebelum memindahkan bakteri ke kaca objek kita harus memijarkan dulu jarum ose dan tabung reaksi bakteri, setelah itu ambil sedikit saja bakteri dari biakan induk bakteri lalu gesekan pada kaca objek secara hati- hati. Kalau bakteri terlalu tebal tetesi dengan air, dan sebarkan secara merata.
Ose (lup inokulasi) merupakan alat dasar dalam praktikum mikrobiologi yang terbuat dari bahan tertentu seperti kawat platina, namun yang lebih umum digunakan di laboratorium pengajaran dan lebih murah harganya ialah kawat nikrom (nichrome) dengan diameter lingkaran pada ujung lup berkisar antara 2 sampai 4 mm (Hadioetomo, 1993).
Sel bakteri berukuran sangat kecil dan tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan object glass masih bisa menampung beberapa bakteri bacillus yang ditumpuk vertikal, artinya tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk berenang ke atas dan ke bawah. Jangan menganggap gambar yang terlihat pada mikroskop adalah gambar datar. Kontrol sangatlah penting, meskipun kita sulit untuk mendapatkannya. Akan tetapi lebih baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan dengan bakteri lain yang telah diketahui bentuknya dengan pasti (http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) (23/10/2009)
Teknik yang digunakan dalam pembuatan preparat ada berbagai macam tergantung pada spesimen dan penelitian yang dibutuhkan, antara lain :
1. Kriofiksasi yaitu suatu metode persiapan dengan menggunakan teknik pembekuan spesimen dengan cepat yang menggunakan nitrogen cair ataupun helium cair, dimana air yang ada akan membentuk kristal-kristal yang menyerupai kaca. Suatu bidang ilmu yang disebut mikroskopi cryo-elektron (cryo-electron microscopy) telah dikembangkan berdasarkan tehnik ini. Dengan pengembangan dari Mikroskopi cryo-elektron dari potongan menyerupai kaca (vitreous) atau disebut cryo-electron microscopy of vitreous sections (CEMOVIS), maka sekarang telah dimungkinkan untuk melakukan penelitian secara virtual terhadap specimen biologi dalam keadaan aslinya.
2. Fiksasi yaitu suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik (seperti kenyataannya ) dengan menggunakan glutaraldehid dan osmium tetroksida.
3. Dehidrasi yaitu suatu metode persiapan dengan cara menggantikan air dengan bahan pelarut organik seperti misalnya ethanol atau aceton.
4. Penanaman (Embedding) yaitu suatu metode persiapan dengan cara menginfiltrasi jaringan dengan resin seperti misalnya araldit atau epoksi untuk pemisahan bagian (http://id.wikipedia.org/wiki/Mikroskop_elektron#Teknik_pembuatan_preparat_yang_digunakan_pada_mikroskop_elektron) (23/11/2009).
Bacillus adalah contoh-contoh organisme yang mempunyai kapasitas untuk pertahanan, salah satunya adalah sel vegetatif yang aktif secara metabolik, tipe-tipe sel inaktif secara metabolik disebut spora. Kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan untuk keberlangsungan aktivitas sel vegetatif, biasanya pada saat kurangnya sumber nutrisi karbon, sel ini mempunyai kapasitas untuk mengalami sporogenesis dan memberikan reaksi untuk pembentukan struktur intraseluler baru (endospora) yang dilindungi oleh lapisan yang tidak dapat ditembus air (tahan penetrasi) dikenal sebagai jaket spora (spore coats) (Cappuccino & Sherman, 1983).


Klasifikasi :

Bacillus subtilis
Kingdom : Bacteria
Phylum : Firmicutes
Class : Bacilli
Order : Bacillales
Family : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Species : Bacillus subtilis

Sarcina Basil
Kingdom : Bacteria
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Ordo : Lactobacilales
Family : Sarcinacaceae
Genus : Sarcina
Spesies : Sarcina basil

(http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis) (15/11/2009)

Membuat pewarnaan tunggal dan pewarnaan majemuk
Tujuan dari pewarnaan adalah untuk memudahkan melihat bakteri denagn mikroskop, memperjelas bentuk dan ukuran bakteri seperti dinding sel dan vakuol, menghasilkan sifat- sifat fisik dan kimia yang khas dari pada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu : fiksasi, peluntur warna, substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Pewaranaan gram pertama kali mulai dikembangkan pada tahun 1884 oleh ahli histology yaitu Cristian gram (Capucino dan Sherman.1983)
Pengecatan Gram
Pengecatan Gram merupakan salah satu teknik pengecatan yang dikerjakan di laboratorium mikrobiologi untuk kepentingan identifikasi mikroorganisme. Morfologi mikroskopik mikroorganisme yang diperiksa dan sifatnya yang khas terhadap pengecatan tertentu (pengecatan Gram) dapat digunakan untuk identifikasi awal. Pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cepat dan biaya murah serta, dalam kasus tertentu, dapat membantu dokter untuk memulai terapi suatu penyakit tanpa menunggu hasil kultur. Metode pengecatan tersebut pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode pengecatan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Dwidjoseputro, 1994).
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. (http: www.wikipedia. Pewarnaan gram. Com) (23/11/09).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.
Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya berbentuk seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan). Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna merah.
(http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/) (23/11/2009).













F. DAFTAR PUSTAKA

Capuccino. J.G & Natalie S. 1983. Microbiologi A laboratory manual Addison- Dwidjoseputro, D., 1989. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Malang.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia: Jakarta.
Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Wesky- Publishing Company. New york
Subandi. 2009. Dasar-dasar Mikrobiologi.Gunung Djati Press : Bandung.
Erlangga: Jakarta.
(http://masrurenstein.blogspot.com/2009/05/mikrobiologi-umum.html) (23/10/2009).
(http://blogkita.info/my-kampuz/my-kuliah/mikrobiologi/pembuatan-preparat-pengecatannya/) (23/10/2009)
(http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/) (23/10/2009)
(http: www.wikipedia. Pewarnaan gram. Com) (23/11/09).
(http://qi206.wordpress.com/2008/10/17/mikroumpewarnaan-gram/) (23/11/2009).
(http://en.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis) (15/11/2009)
(http://id.wikipedia.org/wiki/Mikroskop_elektron#Teknik_pembuatan_preparat_
http://ekmon-saurus.blogspot.com/2008/09/kunci-awal-identifikasi-bakteri.html) (23/10/2009)